单抗制备技术进展
从人类发明这个技术开始，单抗制备已经有30多年的历史了，这些年以来，主流单抗制备的基本主线几乎没有什么改变，也就是下面这个流程：
抗原制备 → 动物免疫 → 细胞融合 → 克隆筛选 → 克隆化（亚克隆）→ 大规模生产、纯化以及鉴定
但是不同的研究人员从不同的角度和细节对整个流程有了独到的视角，这里我简单地总结一下近年以来的发展和前人的经验，基本都是站长自己道听途说，加上参阅一些文献总结出来的，十年以前的技术革新择重点简要提一提。
一、抗原制备进展
抗原，基本上分三类：蛋白、多肽和小分子化合物。
一般的制备过程没什么好说的了，主要说多肽和小分子连载体的事。多肽和小分子因为免疫原性弱，所以必须连接载体才能诱发免疫应答。最常用的基本上就是KLH、BSA、OVA和GST，但是觉得近几年以来，用多肽复合抗原肽（MAP）的比较多。其原理是把多肽或小分子连在多聚赖氨酸的骨架上，而多聚赖氨酸因为其结构具有高度重复性，所以不会像KLH等载体一样使动物产生抗体，这样就不会浪废有限的免疫系统资源。毛病是这种形式的抗原在制备成本上贵许多，一个MAP的制备报价大约在1500元人民币左右。
从获取方式来看，对于蛋白质类抗原，不仅可以重组表达（原核和真核），还可以直接从天然组织或细胞中分离。早期的时候人们经常干这种事，那是因为当时没有现在这么普及的分子生物学技术，很难得到重组蛋白。但是最近20年以来，基本上都用重组蛋白了，重组蛋白生产技术非常成熟，而且生产也简单，容易扩大规模，但是慢慢地很多人意识到重组蛋白和天然的蛋白在结构上有时候有着极大的差异，所以不少人认为确实是天然蛋白免疫得到的抗体是最好的。
在抗原的形式上，也是各式各样，根据自己的需要有不同的喜好，大部份人都推荐接近天然构象的蛋白，即使是重组蛋白，buffer也尽量gentle，另一些人则喜欢跑胶然后切胶打动物，还有的转膜后剪膜免疫动物（这一个通常和从天然组织中纯化的方法联用）。还有人喜欢用过表达的细胞或转化的细菌作为免疫原。对于做免疫组化用的单抗制备，则还有更特殊的处理手段。
另一些人则认为，用DNA直接免疫也许更好。其方法是把cDNA连到真核表达载体中，然后直接注射动物，在佐剂的作用下载体就带着cDNA进入动物细胞，然后在动物细胞就有目的蛋白表达出来，这些蛋白从细胞释放出来后就可以引起免疫应答，这种方法免疫中，现在缺少有效的佐剂，所以免疫效果很难保证，不过在比较低的效价下，很多人也可以得到阳性克隆。
二、动物免疫
实验动物的选择：做单抗的动物最开始是小鼠，后来又有像epitomics这样的公司用兔子的，还有一些人用大鼠等，当然其它的动物的也有，据不完全统计，现在能用传统方法制备单抗的动物已经有二三十种了。但是最主流的还是小鼠和兔子了。小鼠，用得最多的还是Balb/C了，因为大多数骨髓瘤细胞（SP2/0、X63、Ag8.653、FO和NSO）都来自于Balb/C小鼠，为了使hybridomas稳定，所以实验小鼠基本上还是Balb/C。不过有文献提到了用NZB/W小鼠制备高同源性单抗的，原因是NZB/W小鼠是一种容易发生自身免疫疾病的小鼠模型。
免疫佐剂：这一个方向在近十几年以来倒是发展得很快。最开始的时候Sigma的弗氏完全佐剂和不完全佐剂一直是黄金组合（铝盐佐剂也用得比较多），但是后来人们发现CFA/IFA毛病很多，诸如不利于动物健康、刺激免疫应答周期过长等等，于是各种新式佐剂层出不穷，几乎每家试剂公司都有自己独特的佐剂。而且有效成份也多种多样，如脂质体、CpG、细胞因子、分子伴侣、特殊化学药物（如左旋咪唑）、细菌或病毒的全部组份或部份（如LPS、肽聚糖），甚至还有一些是中草药提取物（如蜂胶、皂甙、当归多糖）。在形式上，大部份还是延用了CFA/IFA的油乳性质，但是这两年来免乳化佐剂在国内发展比较快，如Quickantibody就是，武汉这边还有另一个产品叫赛弗诺的也与其类似，同时这些新型的佐剂对抗原的使用量要求很低，而且免疫周期也短，所以比较受欢迎，毛病是商家对机理保密，用户无法获知其可能潜在缺点。
免疫部位：这个没什么好说的了，也基本上是根据喜好来的，皮下、腹腔、脾内、肌肉、腋下、脚垫、静脉，各种地方免疫都说得过去，而且大家都能成功，不过大部份人还是认为皮下是最有效的，因为皮下含有大量的DC细胞，而DC细胞是重要的APC。这里需要提出的是有一种叫作RIMMS的免疫方式极少人用到，但是据说效果不错。RIMMS即多位点重复免疫（repetitive immunizations multiple sites），意思是在相同的地方低剂量短间隔重复免疫，一般是在小鼠背上皮下选择四五个点，每三天左右在这些点进行低剂量免疫，一般十几天就可以完成免疫。不过成功的实例中，很多人都是取小鼠的淋巴结而非脾脏进行融合的，淋巴结不好取。
免疫周期和间隔：大部份人基本都同意免疫周期和免疫间隔尽量长一点比较好，这样得到的抗体亲和力更高（除了上述的RIMMS外）。甚至有人打完第一针后，再过九个月才打第二针的，作者说效果很好，这个方法显然不适合大规模免疫。另外，一些新型的佐剂则强调短周期也可以得到高亲和力的抗体的。另外最近有文献还对白天免疫动物还是晚上免疫动物更好这一问题作出了探讨，作者认为一些调控免疫的分子也有生物节律性，它们的表达水平是跟随生物钟有规律变化的，在这些调节分子表达水平比较高的时候进行免疫或许可以得到更好的免疫效果。
另外还有体外免疫的，即把脾脏从正常小鼠体内取出无菌培养，直接向培养基中添加抗原。这种方法成功例子也非常多，毛病在于很难得到高亲和力的抗体，几乎所有的抗体都是IgM亚型的。这种免疫方式可能更多地用于很难免疫成功的抗原，特别是小鼠自身抗原的单抗的制备。
三、细胞融合
骨髓瘤细胞：现在用的大多骨髓瘤细胞还是HGPRT-的，也有极少人在科研中用TK-的骨髓瘤。目前sp2/0细胞株是用得最多的小鼠骨髓瘤，但是用FO、NSO或NS1的也不少，其中NS0和NS1出现比SP2/0略早，而且它们还有一个毛病就是它们可以合成抗体的kappa链，不过不分泌出来；FO细胞则是SP2/0细胞亚克隆筛选得到的，染色体和SP2/0一样也是72条，它的特点在于其生长速度非常非常快，在含优质血清的培养基中，SP2/0的倍增时间大约为15小时以上，但是FO的倍增时间经常只有七八个小时，所以养起来就容易多了。
融合的介导：这个30年来基本没什么改进，化学法主流PEG，另外少数人用电融合，其中PEG介导融合操作方便，成本低，稍作优化基本可以满足绝大多数人的需求。值得一提的是一种基于微流控芯片的细胞融合技术，将A细胞通过此芯片被捕获在芯片上的小杯中，再用反向的液流逆向冲刷细胞，经过这一步后，大杯里基本上满足一杯一个A细胞，然后再将B细胞流过大杯而被大杯捕获，最终的结果就是一个大杯里有一个A细胞和一个B细胞，最后再融合它们，据说这个方法可以使50%左右的脾脏细胞参与融合，而我们现有的融合方法只有不到0.1%的脾脏细胞参与融合。
在制备传统单抗的同时，还有人想制备出双特异性单抗，即制备出来的单抗可以同时识别两个表位。
写到这里，我想和大家一起回忆一下单抗的定义：只识别一种表位（抗原决定簇）的抗体，来自单个B淋巴细胞的克隆或一个杂交瘤细胞的克隆。这个定义下得非常好，同时有个细节需要注意，单抗不只是来自杂交瘤细胞，还可以直接来自B淋巴细胞！我们进行细胞融合的主要目的就是为了使B细胞可以无限传代，所以如果有办法让B淋巴细胞（准确地说应该是浆细胞）直接具有无限传代的能力那是不是不用细胞融合这一步了呢？答案是肯定的！Renata Pasqualini和Wadih Arap早在2003年就发表了一篇文章：Hybridoma-free generation of monoclonal antibodies，就讲到了完全不需要杂交瘤而制备单抗的办法：将抗原注射到H-2Kb-tsA58转基因小鼠体内，免疫结束后，直接将脾脏细胞磨成单个细胞，于33度培养即可。原理：该实验中小鼠转了SV40大T抗原和由干扰素诱导的主要组织相容性复合物H-2Kb（作为启动子），这种小鼠的细胞在Gamma干扰素诱导下，于33度的许可温度时就表达TsA58基因，这是一种来自猿的肿瘤基因，表达这个基因的细胞具有无限增殖的能力，这样就达到了无限传代的目的了。
四、克隆筛选
克隆筛选无疑是整个单抗制备过程中相当关键的一步，在单抗制备史上，单克隆筛选一共可以分为三个时代：第一代筛选基本上都是基于红细胞花环形成实验为代表的凝集反应的方法，第二代就是主流的间接ELISA，第三代则是ELISA（或缺）结合特定实验目的的综合筛选方法。
后来人们慢慢地发现，虽然ELISA阳性的克隆可以很多，但是真满足实际需要的克隆非常之少，拿常见的WB来说，一般六七株里通常只有一两株可以做WB，而IHC则更悲剧，一二十株细胞里才有一两株能满足实际应用的或者数十株里也没有一株合适的，所以大家觉得在筛选的时候最好有两种或者更多的鉴定方法，而且其中有一种是与实验目的相同的筛选方法。
这里说说一些比较特殊一点的方法。第一个方法是印迹显色法，是一种建立在半固体培养基础上的筛选方法，即把杂交瘤从一开始起就养在半固体培养基上（表面），数日后将灭过菌的NC膜铺在培养基上，NC膜可以直接与细胞接触，于是细胞所产的抗体也被NC膜吸收，经过一段时间后取出NC膜，封闭，再将膜泡在经过标记的抗原上，最后显色即可。第二种方法是一种可以被称为"原位荧光筛选"，也是基于半固体培养基的，其方法是将抗原标记上荧光，然后加到半固体培养基中，将融合后的细胞养在此培养基中培养，随着杂交瘤的生长，阳性克隆逐渐分泌抗体，于是半固体培养基中标记过的抗原逐渐聚集在阳性克隆周围，当激发光激发抗原上的标记物时，阳性克隆就表现为周围都呈现荧光，将这些阳性的细胞挑出即可进行后续步骤。挑克隆的过程既可以手工完成，也可以借助机器完成。德国的AVISO GmbH公司的CellCelector和Life Technologies的ClonePix FL就是这样的仪器。
最后再总结一下适用于高通量单抗制备的一些筛选方法。首先是蛋白质芯片筛选，直接将作为抗原的蛋白质喷点在膜上、玻璃基质上或者酶标板内，再进行间接ELISA的方法。另一种方法是借助于刚才说到的原位荧光筛选。第三种方法，是基于分子之间相互作用的一种筛选方法，使用GE公司的Biacore之类的仪器。最后一种高通量筛选就是站长自己在用的方法。
总之，筛选过程是整个单抗制备中犹为重要的一步，一个优秀的筛选过程对于单抗制备来说非常重要，筛选过程不仅要可靠，还要快速，因为细胞不能在同一孔养太久，所以一般一天内完成筛选最好，同时筛选的手段要尽量接近实际应用实验。
五、单抗的大规模制备、纯化与鉴定
在筛选到阳性的细胞株后，在进行扩大规模生产之前一定要反复确认此细胞株产生的抗体是否真正地能够达到应用标准。
大规模生产：大规模生产单抗的方法分为体内法和体外法，体内法最常见的就是制备腹水了，这种方法产生腹水，有效抗体浓度基本在0.5-5mg/ml之间，大部份都集中在1-2mg/ml左右，一只小鼠可产4-10ml腹水。另一种体内法是将细胞注射到大型动物子宫内的方法，可以从动物子宫内一次性获得几升的液体，其中抗体浓度在5-20mg/ml，相当高了，不过后来这个方法就没人使用了，估计操作麻烦同时涉及动物福利问题。
另一种扩大规模生产的方法是在体外进行，最初的体外培养基本和养菌差不多。一般认为，如果抗体的需要量在10mg以下，基本的方法就是直接用多个flask进行独立培养；如果抗体的需要量在10-100mg之间，则用转瓶培养比较合理；需要量在100mg-1g之间，可选用渗析管进行；在1g至10g范围内，可以用中空纤维柱进行；在10g-10Kg的范围内，可以考虑用不同规格的发酵罐培养。
纯化：在纯化之前，通常需要对腹水或者细胞培养上清进行初步除杂。单抗的纯化手段较多，常用的纯化方法有盐沉淀法（主要是辛酸-硫酸铵法）、离子交换法、亲水疏水层析、凝胶过滤法（尤其是纯化IgM亚型抗体的时候常用），再就是各种亲和纯化了，目前商业化的亲和纯化填料有Protein A、G、L。Protein L则是最近几年才流行起来的，主要识别抗体的kappa chain，而小鼠单抗有95%的机率为kappa型，所以可以用它纯化，但其在纯化IgM亚型的抗体时优势较明显。用Protein A、G、L这类填料可以很容易实现10g级抗体的纯化，而且纯化的产品纯度相当高，但因填料较贵，所以一般只作为最后一步使用。
需要指出的是，小规模纯化抗体基本不用过于考虑成本问题以及操作的复杂性的问题，但是当采用体外法大规模生产时，通常用多种纯化方法相结合，以达到最理想的纯化效果（高回收率、高纯度、低活性损失），同时又可控制成本。在放大体系之前，都需要做小试进行严格的论证才可以达到事半功倍的效果。
后记
到这里，传统单抗制备方法的一些新的进展差不多就这些了，由于本人水平有限，参考的文献也有限，所以有不周到之处，请大家多多指正。另外，说到进展，其实整个单抗的最大的进展也是最有经济前景的进展当数人源化单抗了，已不属于此话题讨论范围，日后再另外讨论。
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