一个脾脏中，能分泌抗体的细胞占的比例很少，90%以上的细胞是不能分泌抗体的。即使进行了人工免疫，能分泌出针对人工免疫的抗原的抗体的细胞占能分泌抗体的细胞的比例也是很低的。因此，尽管一个成功免疫的脾脏可达到2×10
8个细胞以上，但进行了细胞融合后能得到目标杂交瘤的数量也是很有限的，如何筛选出这些能分泌目的抗体的杂交瘤是一个非常关键的问题。
一般来说， 制备单抗的目的决定了筛选克隆所用的方法。但是实际制备过程中，融合后得到的克隆非常多（一般在500个-2000个克隆），而细胞在形成克隆后，在同一个培养孔中培养的时间不能太长，否则容易长满，因此初步筛选应该选择一个非常快速的方法。目前主要有这么几种方法：（1）间接血凝实验（IHA）。即将抗原偶联到红细胞上，然后加入待检测的细胞上清，上清中如果有能识别抗原的抗体，那么红细胞将会聚集。这种方法不需要太多的设备，但是操作比较麻烦。（2）免疫荧光（IF）或免疫细胞化学（ICC）或免疫组织化学（IHC）。这三种方法的原理比较类似，都是将能天然表达出抗原的细胞或组织固定，再加入待检测的细胞上清，然后加入二抗，最后显色，这种方法可以通过定位是否正确来判断细胞上清中是否有正确抗体。（3）酶联免疫吸附试验（ELISA）。
由于融合后，细胞上清份数多，但每份体积有限，因此ELISA是最适合用于初步筛选的方法。关于ELISA的原理讲解，在本站的其它页面将有详细的介绍，这里就简单地讲一下间接ELISA用于筛选克隆的主要步骤。
（1）包被。将抗原以pH 9.6的NaCO3-NaHCO3包被，每块酶标板以5-20ug抗原为宜（如果抗原为多肽或小分子物质，则需要加大包被量）。每孔的包被体积为50-100ul。37℃包被2h或4℃包被过夜。
（2）封闭。倒掉抗原，拍干酶标板孔内液体，以0.5-1% BSA（用PBST溶解）或5% 脱脂牛奶（PBST溶解）或1% 明胶（PBST溶解）于37℃封闭2h或4℃封闭过夜，也可以使用10%小牛血清或其它无关物种血清封闭。封闭完后可立即使用，也可以洗涤一次置于4℃密封保存以备后面使用。
（3）一抗。封闭完后，弃去孔内液体，拍干，加入待检测细胞上清，每孔100ul为宜。在每块板子上做好记号。37℃孵育1h。
（4）二抗。孵育完一抗后，弃去孔内液体，拍干，以PBST洗涤3次，每次5min。根据二抗说明稀释好二抗，每孔加入100ul.37℃孵育1h。
（5）显色。孵育完二抗后，弃去孔内液体，拍干，加入显色剂。待颜色最深时用终止液终止反应。用酶标仪读出各孔OD值，选择出阳性孔。
如果所用的抗原比较珍贵，而且量又少，可以做两次ELISA。第一次将细胞上清直接包被在酶标板上，无需封闭，加入二抗，洗涤后显色，可以筛选出可以分泌抗体的细胞株，再从这些可以分泌抗体的细胞株内做第二次ELISA，这一次用上面讲到的方法进行，这样可以减少抗原用量。
经过ELISA筛选出的阳性克隆即可进行克隆化，或者在允许的情况下继续培养作其它的鉴定实验（如WB，IHC，IF等实验）。一般建议先进行克隆化，因为如果不进行克隆化，当阳性孔有非抗体分泌型的杂交瘤时，非抗体分泌型的杂交瘤由于生长速度更快，将会占主导生长，最终很难分离出目标杂交瘤以至丢失。
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这一部份讲解比较简单，详细的讲解可以看看ELISA栏目下的讲解，大家可以根据自己的实际需要设计不同的筛选方法，也可以尝试使用新型快速筛选手段（如蛋白质芯片、荧光激活细胞分离技术等），希望了解其它筛选手段的朋友可以在本站论坛上发帖交流（需要文献的也可以论坛提出，站长将陆续上传资料），也可以加入中国免疫学实验网QQ群和大家及时联系： 42654080。中国免疫学实验网感谢您的光临！
