多抗的纯化是一件比较简单的事情，因为人工干预比较大，所以对实验者的操作依赖性较强。很多新手觉得这是一件比较复杂困难的工作，但是如果理解了原理，就可以自行改进实验了。多抗纯化方法比较多，过去有用盐析法纯化的，有用辛酸-硫酸铵沉淀的方式纯化的，也有用冷酒精沉淀的方式纯化的，也有后来的离子交换层析和Protein A,G,A/G纯化的，但是在今天，市场上几乎所有的抗体都是通过抗原亲和纯化得到的，与其它方法相比，抗原亲和层析得到的抗体效率高、产量高、产品纯、操作简单。鉴于很多网友问起这方面的问题，我就详细地讲一讲亲和纯化原理和操作。
说到亲和层析，还得从上个世纪60年代说起。当年美国NIH（National Institutes of Health）有个学生在研究一种酶和抑制剂之间的相互作用的时候，突发奇想：既然此酶可以和抑制剂结合，那如果把抑制剂固定起来，不就可以用来纯化酶了吗？试了一下觉得果然可行于是发了一Paper，从那之后，就出现了各种各样的亲和层析，亲和配基与配体可以是酶与底物、酶与抑制剂、激素与受体、抗原和抗体、糖蛋白与凝集素、生物素与亲和素、组氨酸与二价金属离子、卟啉环与亚铁离子等。亲和层析精髓：将一种分子固定，用来吸附另一种特异性分子，最后将其洗脱下来。
言规正传，多抗的亲和层析是基于抗原与抗体结合的一种层析方式。基本思路是将抗原固定在一种基质（也就是柱的填料，大家都叫beads）上，然后与抗血清孵育以捕获相应的抗体，然后从基质上洗掉非特异性结合的抗体，最后再将抗体洗脱下来。一个经典的亲和纯化流程如下：
1、介质的制备。目前大部分亲和柱介质都是基于琼脂糖（Agarose）或者葡聚糖(Dextran)。由于琼脂糖稳定性好、对蛋白质的非特异性吸附低、适宜活化，因此是制备抗原亲和柱填料的理想材料。单纯的琼脂糖是不能和蛋白质直接相连的，因此需要给它加一个有活性的臂，这就有点类似多肽与载体蛋白的偶联需要一个双功能试剂一样。琼脂糖加臂（活化)的方法比较多，其中涉及的原理也和多肽与载体蛋白偶联类似，最常用的活化试剂是溴化氰和环氧氯丙烷，另外二溴丙醇、N,N'-羰基二咪唑、双环氧化物等也可以用来活化琼脂糖。
溴化氰对琼脂糖的活化机理如下：
环氧氯丙烷活化机理如下：
关于如何操作的问题，可以参考文献，也可以在本站论坛和大家交流（等本站完成，站长将会陆续上传文献至论坛）。如果你想自己制备，为了你和他人的安全，请不要使用溴化氰活化，溴化氰有剧毒，极微量的摄入都有可能造成死亡，本站对此类事故不负任何责任。如果是单纯做一次或几次小量抗原亲和纯化，建议购买商品化的填料，GE Healthcare就有卖的（Cat. NO.为17-0430-01）。 以下的介绍就基于此填料说明书展开叙述的。使用此种填料首先需要将其进行预处理，预处理方法是：称取适量的beads（一般0.5g beads可以一次性纯化10ml左右血清，可以反复使用）倒入pH 2.0 HCl中，四度让其吸胀15min，体积膨胀比例为：1g可以膨胀至3.5ml，然后将其装入漏斗中，用pH2.0 HCl充分洗涤（体积为beads膨胀后的50倍以上）以除去保护剂。千万不可用中性或碱性试剂洗涤，否则beads会水解。
2、抗原与填料的连接 这一步是整个纯化过程中最关键的一步，如果在这一步上有什么失误，建议你从step one重新开始吧。 首先要注意一点：常见的连接方法都基于抗原上的游离氨基或者巯基与活化后的beads的连接，因此体系中不应该有其它含有氨基或巯基的化合物，包括尿素、硫脲、盐酸胍、Tris、铵根离子、Beta-巯基乙醇等，如果有这些物质在体系中，应该首先设法除去。
溴化氰活化的琼脂糖与氨基化合物反应的机理如下：
环氧氯丙烷活化的琼脂糖与氨基化合物反应的机理如下：
连接反应进行的条件：（1）Buffer体系。上述两个连接反应都应该在碱性环境下进行。pH宜在8-10之间，推荐使用Na2CO3-NaHCO3体系,pH尽量偏离蛋白的等电点，但不可高于10，否则填料很容易水解。pH也不能过低，否则抗原的氨基或巯基会被质子化，无法与beads结合。也可以考虑用其它的缓冲体系，但是绝对不可引入带有游离氨基或者巯基的化合物。为了防止蛋白类抗原的聚集，体系中还可以加入0.5M NaCl以提高盐离子浓度。（2）蛋白质浓度。为了达到比较快而且比较彻底的反应，抗原浓度应尽量提高（也就是高中课本上讲的勒沙特列原理），但过高的浓度有可能造成聚集形成沉淀。一般推荐浓度是5-10mg/ml。需要注意的是beads的承载量并没有这么大。用来连接的蛋白在buffer体系中必须完全溶解，如果不能溶解可以尝试加入去垢剂，多肽等小分子化合物可以用DMSO、DMF、二氧六环助溶。（3）反应温度与时间。此反应可以在室温进行，一般来说，室温4小时反应足够完成，如果担心抗原降解，可以在4℃进行，需要过夜反应。
3、连接效果的评估 有经验的同仁这一步基本可以不做，但是对于新手来说做了这一步心里更有谱一些。这个过程尽量用比较简单的实验来做比较好，推荐使用考马斯亮蓝法（Bradford法），但是体系中如果含有去垢剂，建议改用其它的方法（如BCA，Lowery、凯氏定氮法等），也可以取连接后的上清液（离心后）拿去做SDS-PAGE判断。确认连接没有问题后，以将体系转入柱子里除去连接后的液体，如果没有柱子，也可以用离心的方法进行，下同。
4、多余位点的封闭 为了保证连接效率，beads的量通常是过量的，因此连接完后，beads上就有很多多余的空位点，如果不把它们封闭，那接下来的一步里就会与血清中的抗体结合，这样就会影响抗体得率。 含有氨基的小分子化合物都可以用来进行封闭，如尿素、Tris、乙醇氨、单一氨基酸，大分子物质是不适宜用来封闭的，因为它们的空间位阻会影响下一步中抗体与抗原的结合。封闭条件与连接条件基本类似。封闭完成后，除去封闭液，用PBS洗柱三次。
5、抗血清与beads的结合 血清事先经过10000g 离心5min，有条件的还可以通过0.45um滤膜过滤。将血清用PBS稀释一倍，然后加入连好抗原的beads，密封好，4℃摇晃过液或者室温摇晃3至四小时，摇晃时最好能颠倒来回摇动，确保所有beads都能悬在液体中。室温孵育时间不宜过长，否则会引起非特异性吸附，同时影响抗体质量。
6、非特异性结合的抗体的洗涤 第5步完成后，过柱或者离心去掉血清成份，用PBS洗涤三次。然后再用一个稍稍Harsh一点的体系去洗掉与抗原非特异性结合的蛋白，怎么样的体系算是比较Harsh呢？ 一种是偏酸或偏碱一点的pH，可以加酸或加碱将PBS或生理盐水的pH调至偏酸（5.0）或偏碱（8.5）作为洗涤液，用10倍柱体积洗柱一次，也可以直接用150mM Gly，基本不用调pH就是pH=5.0了。另一种体系是高盐离子浓度，例如可以在PBS里加入NaCl至终浓度为1M，10倍柱体积洗涤一次。两种体系的本质都是减弱蛋白质分子间的作用力。
7、洗脱 经过第6步的操作后，结合在柱上的抗体就非常纯了，同时那些亲和力弱的抗体也被洗掉，于是可以开始洗脱了。洗脱方法和上面的洗涤原理基本类似，只是条件更苛刻一点。通常用得比较多的办法是用pH 2.5左右的HCl（含150mM NaCl)洗脱，也可以采用碱性洗脱液洗脱。洗脱有两种方式，一种是连续洗脱，另一种是不连续洗脱。前者是连续入加洗脱液，即时监控洗脱情况并随时决定收集目的抗体组分。不连续洗脱则是分批加入洗脱液，分批收集洗脱流出的成份，最后再对每一次收集的组分检测。如果用前一种方法，最好有一台紫外监测仪检测流出组分以便即时监控，后一种方法的检测则相对比较简单一些，只要是可以对蛋白质进行定量的方法都可以使用（如Bradford法、Lowery法、BCA法等都可以），总之就是越简单越好。洗脱过程尽里在低温完成，洗脱下的组分应该在冰盒上放置，洗脱下来后的成份应该立即调节pH至中性，调节pH应该使用缓冲液，而不应该直接使用强酸或强碱，Na2HPO4、Na2CO3和Tris等缓冲液是用来作为中和液的不错选择。需要指出的是，如果需要将抗体进行偶联荧光素或者酶的时候，就不能使用Tris作为中和液，否则会影响后面的边接效率。
8、抗体的保存 抗体纯化完后，必须采取合适的保存，否则很容易就失去活性。总的来说有这么几个方面需要注意：（1）缓冲体系。纯化后的抗体必须处于一个相对接近体液的缓冲体系中，一般的PBS体系就足够了。注意不要引入高浓度的离子，尤其是金属离子。不要引入干扰抗体实验的离子或基团。（2）防腐剂。为了防止抗体长菌，必须加入防腐剂，常见的防腐剂有：叠氮钠、硫柳汞、抗生素（庆大霉素）。叠氮钠的常用浓度是0.02%，硫柳汞和庆大霉素的常用浓度为0.01%，其中叠氮钠会抑制HRP酶活性，因此在需要偶联HRP酶的抗体中不能加这种防腐剂，而且叠氮钠会影响细胞色素氧化酶活性，会干扰机体的呼吸作用，因此操作时需要注意安全。 硫柳汞对儿童具有潜在毒性，使用时也应注意。（3）稳定剂。向抗体中加入稳定剂可以大其稳定性，常见的稳定剂有多羟基类化合物（二元醇、三元醇等，如浓度为30%-50%的甘油、乙二醇）、二糖类物质（如蔗糖、海藻糖等）、氨基酸、蛋白质（如BSA等），如果抗体需要进行标记，则不可以加入氨基酸、BSA等保护剂。（4）温度。长期不用时，抗体应该低温保存，一般采用-20℃保存。短期不用可以放在4℃，但不要超过一周。抗体绝对要避免反复冻融，前面提到的加入甘油等既可以起稳定作用，还可以起防冻的作用。如果有条件，可以把抗体进行冷冻干燥形成冻干粉，放在-80℃。如果抗体尚未纯化，直接以血清的方式保存在-20℃以下，也可以很好地保证其活性。（5）浓度。和普通蛋白质一样，浓度越高就越利于保存。如果抗体浓度太低，可以采用超滤、protein A或Protein G（操作方法参考单抗纯化相关介绍）、透析袋等方式浓缩。超滤的方式操作简单，直接将抗体装入超滤管再进行离心即可。透析袋浓缩操作也比较简单，将PEG（分子量大于8000）配成50%左右的溶液，用合适孔径的透析袋装好抗体，然后放入PEG溶液中搅拌浓缩即可。关于Protein A或Protein G浓缩的方法将在单抗纯化相关页面讲述，需要指出的是这用这两种亲和柱浓缩的损失可能比较大。（6）存储时间。抗体在-20℃并含有甘油的情况下可以存放数年至十几年（不要反复拿至温室）。在4℃存放的时间一般在一个月左右就可以有明显的效价变化。冷冻干燥的冻干粉低温可放置几十年。
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这一部份讲的内容比较多，具体操作方面只是带过，希望读者能通过原理能够进行自行设计实验，既可以随机应变，也可以提高实验设计的思维。如果还有什么问题，可以加入中国免疫学实验网QQ群：42654080。需要文献的朋友请先在本站论坛上发帖，站长将陆续上传资料。
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