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  细胞融合
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  细胞融合>>>>

     细胞融合:广义上的细胞融合指两个或者多个细胞的原生质体融合形成一个杂种细胞的过程。广义上的细胞融合可以是同种属的细胞发生,也可以是不同种属的细胞发生。 在单抗制备过程中的细胞融合专指瘤细胞与脾细胞的融合。 在介绍融合技术之前,有必要先了解一下骨髓瘤细胞。

    骨髓瘤细胞的选择 在前面概述部份就讲到,为了便于筛选出成功融合的杂交瘤细胞,需要选择DNA合成主要途径缺陷型的骨髓瘤细胞(HGPRT-或TK-)与脾细胞融合,通常是HGPRT-的骨髓瘤细胞。要得到这种细胞需要做两件事,第一是得到骨髓瘤细胞,第二步是诱导和筛选出HGPRT-的骨髓瘤细胞。一般可以通过向小鼠腹腔内注射碳氢化合物、石蜡或者油类物质而诱发其产生骨髓瘤细胞,通常的做法是注射降植烷(Pristane,又称姥鲛烷)。诱导出骨髓瘤后,在无菌条件下取出此骨髓瘤,用完全培养基培养一段时间后,再用8-氮杂鸟嘌呤或者5-溴脱氧尿嘧啶核苷酸进行筛选即可得到HGPRT- 的骨髓瘤细胞。对于第一步的诱导过程,目前只有BALB/C和N2B品系的小鼠才具有高度的敏感性。目前最常用的骨髓瘤是来自BALB/C小鼠的,为了减小远亲属种系之间的排斥反应,单抗制备中用来免疫的动物品系应该与骨髓瘤来源的品系相同。1972年,Potter第一次从Balb/C小鼠中分离骨髓瘤细胞株MOPC,第一次用于脾细胞融合的骨髓瘤细胞株为P3-X63-Ag8,简称X63或P3,它由Milstain实验室将P3K(源自MOPC)细胞系经8-Aza筛选得到。X63自身不能分泌完整的免疫球蛋白,但是可以合成并分泌γ1重链和κ轻链,因此如果用X63骨髓瘤细胞与脾脏融合,得到的融合细胞除分泌脾细胞的抗体外,还可以分泌X63的γ1链和κ链。后来又从P3K细胞系选育出另一变种P3-NS1-Ag4-1,简称NS-1,它不能合成 γ1重链,能合成κ轻链,但是合成之后在细胞内降解而不能被分泌出来。后来人们又陆续地筛选出完全不产生自身Ig的骨髓瘤细胞系,如最常见的SP2/0。目前可用于融合的小鼠骨髓瘤细胞系种类见下表:

细胞系
简称
来源
染色体数
分泌Ig链
P3-X63-Ag8
P3或X63
Balb/C小鼠MOPC21
65
γ1
P3-NS1/1-Ag4-1
NS1
P3
65
κ(非分泌型)
SP2/0-Ag14
SP2/0
P3和Balb/C脾细胞杂交
72
-
P3-X63-Ag8.653
P3-653
P3
58
-
P3-X63-Ag8-UI
P3UI
P3
-
FO
SP2/0-Ag14克隆
72
-
S194/5.XX0.BU1
S194
Balb/C小鼠
κ(非分泌)
MPC11-X45.6TG
MPC11
Balb/C小鼠
62
IgG2b,κ

    用于融合的骨髓瘤细胞在使用前应先置于含有八-氮杂鸟嘌呤或者5-溴脱氧尿嘧啶核苷酸等筛选培养基中培养,以确保骨髓瘤细胞无回复突变,此过程持续两周左右改为正常完全培养基培养。在融合前,骨髓瘤细胞必须保持非常良好的状态才可以保证有较高的融合率,一般保证生长至60-80%左右密度时认为是对数生长强壮期。另一种比较好的解决方案是(以SP2/0细胞为例):将复苏培养数天的骨髓瘤接种于小鼠皮下,约两周后小鼠皮下就会生长出可见的肉瘤,将此肉瘤无菌取出研磨成单个细胞,计数后也可用于融合。

    脾脏单细胞悬液的制备 完成小鼠的免疫流程后,间接法ELISA测定血清效价在1:8000以上或免疫扩散实验效价在1:16以上时即可进行冲击免疫(详见单抗制备动物免疫一节),冲击免疫完成后96小时内处死小鼠,(也有少数时候例外的时候,站长自己做过一次血清ELISA效价在1:2000时就进行冲击免疫也获得成功),处死小鼠可采用断颈处死,也可以采用摘眼球放血处死。处死小鼠后,将小鼠浸泡于75%酒精中5分钟,然后用大头针将其四肢固定在干净木板或纸板上(腹部向上),放进超净台,用无菌镊子和剪刀依次剪开皮肤和腹膜,换用另一套镊子和剪刀无菌取出脾脏,放入一小皿中(小皿中事先放好一小块200目细胞滤网),加入几滴不完全培养基,然后用一注射器针芯将脾脏磨成单个细胞,用巴氏管将此细胞转入离心管后,加入适量培养基,离心(1200RPM左右,下同)洗去脾脏中带入的鼠源血清。重复洗一次再用不完全培养基重悬即得到脾细胞悬液。

    细胞融合的介导 自然状态下,细胞之间很难发生融合。1958年,日本冈田善雄利用仙台病毒成功介导动物细胞融合,但是其诱导效率低,而且诱导不稳定,可重复性差。自20世纪70年代起,不断有人发现许多化学试剂也可以使细胞进行融合。主要包括盐类(如NaNO3、KNO3、NaCl、MgCl2、CaCl2)、聚乙二醇(PEG)、二甲亚砜(DMSO)、甘油-醋酸脂、脂质、Ca2+络合物等。后来,人们又发明了电融合和激光融合,更进一步提高了细胞融合的效率。与化学试剂融合相比较,电融合和激光融合效率更高,但是成本也高,操作复杂。因此,目前在单抗制备中都选择化学试剂进行细胞融合,目前最常用的则是聚乙二醇(PEG)融合法,其原理是PEG剥夺细胞周围的水分子,使细胞高度脱水而原生质形成凝集,细胞膜发生扭曲,同时膜内蛋白颗粒易位并凝聚,而膜脂的流动性发生较大改变,相邻的细胞之间细胞膜局部发生融合,之后逐渐扩大,最终发生融合(对PEG融合原理也有人持不同意见,请参考相关文献)。PEG分子量越大,对细胞的毒害也越大,分子量越小,融合速度和效率也较低下。常用的PEG分子量在200-20000之间,更多地是1000-4000之间,使用前用高温灭菌,再用不完全培养基或PBS配制。

    影响细胞融合效率的因素 影响细胞融合效率的因素有很多,以PEG介导的融合为例,主要的因素有这么几个:(1)参与融合的细胞状态。无论是脾细胞还是骨髓瘤细胞,融合前都必须处于一个非常良好的状态。对于脾细胞,要求动物健康,即取即用,即使有非常特殊的情况,取出脾脏后需要在体外先进行培养一段时间的,也不能超过两至三天。骨髓瘤细胞在使用前至少两周应停止使用筛选培养基(如含8-氮杂鸟嘌呤或5-溴尿嘧啶的培养基),使用前保证骨髓瘤的生长密度为80%左右为宜。(2)PEG的分子量和浓度。前面说过,PEG的分子量越大,对细胞的毒害作用就越大,但是分子量越小,融合效果也就越小。PEG的浓度也有类似的关系,因此通常使用的PEG浓度一般在30%-60%之间。需要注意的是,当脾脏细胞与骨髓瘤细胞混合离心后,一定要彻底除掉洗涤液,否则会大大改变PEG的有效浓度。(3)PEG的pH以及作用时间。经验告诉我们,PEG的pH配在8.0-8.2时效果最佳。PEG的作用时间与其分子量成反比,也与其浓度成反比。一般PEG的直接作用时间在一至五分钟。(4)融合时的温度。细胞融合本质上要涉及细胞膜的流动,而细胞膜的流动速度与环境温度成正比。一般融合时的温度都在37-40℃。(5)离子环境。有文献报道,在融合的PEG里添加Ca2+有利于提高细胞融合的效率。文献报道的Ca2+最佳浓度都在50mmol/ml左右。(5)操作上的因素。将脾细胞与骨髓瘤细胞混合前应将二者充分吹打均匀,离心时速度不可太大也不可太小。如果离心速度太大,骨髓瘤细胞会优先沉淀到离心管底部,如果离心速度太小,则脾细胞可能不能完全被沉淀下去。

    细胞融合操作步骤 以SP2/0为瘤细胞为例,一个典型的融合过程如下:

 (1) 按前面讲述的方法免疫小鼠,确认免疫成功后,杀死小鼠,按上述方法制备脾脏单细胞悬液,离心之前取少量悬液进行细胞计数,计算出整个脾脏所包含的细胞个数。

(2)融合前一天将SP2/0细胞传代一次,调整好密度,按经验保证在融合时其密度应在80%左右。融合时,将SP2/0从培养瓶上吹下,离心(800RPM左右,下同)弃去培养基,再用不完全培养基或PBS洗涤一次,弃上清再用不完全培养基或PBS重悬,取少量悬液计数。 如果采用小鼠制备骨髓瘤,可按脾脏单细胞悬液制备方法制备成单细胞悬液。取少量悬液计数。

(3)按SP2/0:脾细胞以1:2-1:10的比例取合适量的SP2/0悬液,将脾细胞悬液和SP2/0细胞悬液混合离心(1200RPM),将上清倒干净。

(4)吸取1ml事先预热至37℃的PEG,在1min内滴入脾脏细胞和骨髓瘤细胞的混合体系中。滴加PEG时动作要轻,并且所有操作尽量在37-40℃环境下进行。

(5)静置1min后,在5min内加入20-30ml不完全培养基,以终止PEG的作用。

(6)离心(1200RPM)去掉上清,再用完全培养基(含HTA和胎牛血清)重悬起融合完成的细胞,将其平均地滴在96孔培养板上(培养板上需在融合前一天滴入饲养层细胞)。平均每个脾脏融合后滴在5-10块培养板上为宜。如果使用半固体培养基培养,可将融合好的细胞混在43℃左右的培养基上,然后倒在平板里培养(这种方法的操作详见“交杂瘤细胞的克隆化”一节。)

 (7)四天后,可以看出培养基颜色变黄,此时应该换液一次,换液后三天时再换一次,显微镜下可以看到克隆形成。继续培养两至三天,便可以检测细胞上清中是否有目的抗体出现。

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    关于细胞融合的部分就写这么多,具体的操作大家可以在百度视频搜索页面上搜索到,这里不再作详细描述。如果需要资料或有任何问题,可以在本站论坛上发帖求助,也可以加入中国免疫学实验网QQ群与网友们即时联系,中国免疫学实验网QQ群:42654080。再一次感谢您的光临!


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