饲养层细胞的制备
什么是饲养层细胞？饲养层细胞就是饲养其它细胞的细胞，但是这里的饲养层细胞不像体外培养的纤维母细胞那样持续地为杂交瘤细胞提供营养物质，因为杂交瘤细胞所需的营养成份均由培养基提供。饲养层细胞的主要作用是提供细胞因子，另外饲养层细胞还可改善培养环境，如饲养层细胞中巨噬细胞可以吞噬死亡细胞和细菌，从而使杂交瘤细胞生长得更好。用巨噬细胞作饲养层细胞的另一个好处是巨噬细胞贴壁牢固，培养上清很容易吸取。
在单抗制备过程中，融合后细胞密度相对较低（主要是由于培养板孔体积较小，而细胞密度偏低），细胞间的相互作用弱，分泌的细胞因子也少，克隆形成率低，所以这时加入饲养层细胞对杂交瘤的形成和生长有明显的促进作用。从克隆形成的角度来说，由于融合后需要稀释细胞以分离出单个细胞，加入饲养层细胞后明显提高克隆形成率，提高阳性孔数量。
常用的饲养层细胞有：腹腔巨噬细胞、胸腺细胞、脾细胞、成纤维母细胞等，也有人直接用巨噬细胞培养上清（conditioned medium）来作饲养。现在也有商品化的饲养层细胞培养上清出售。常用的饲养层细胞制备方法如下。
一、腹腔巨噬细胞饲养层制备
腹腔巨噬细胞是最常用的饲养层细胞，制备方法简单，数量多，效果好。具体操作步骤：
1. 取正常小鼠（与免疫小鼠同品系），脱颈椎处死，浸入75%酒精中消毒。
2. 将小鼠固定于解剖板上，腹部向上，剪开腹部皮肤（注意不要剪破腹膜）。
3. 用注射器向小鼠腹腔内注入3-5ml无血清培养基（或PBS），轻轻揉按腹部1-2分钟。
4. 用注射器吸出腹腔灌洗液，注入离心管中。
5. 1000rpm离心5分钟，弃上清，用完全培养基重悬细胞沉淀。
6. 计数细胞，调整细胞浓度，根据需要接种到96孔板或24孔板中。
7. 一般在融合前一天接种饲养层细胞，每孔加入约104-105个细胞，37℃、5%CO2培养过夜，第二天即可使用。
注意：一只小鼠一般可获得腹腔巨噬细胞约106-107个，视小鼠年龄、品系和操作熟练程度而定。
二、胸腺细胞饲养层制备
胸腺细胞也可作为饲养层细胞使用，制备方法：
1. 取正常小鼠，脱颈椎处死，浸入75%酒精中消毒。
2. 剪开胸部皮肤，取出胸腺，放入平皿中。
3. 用注射器吸取无血清培养基，反复冲洗胸腺，使细胞分散。
4. 将细胞悬液通过200目筛网过滤，去除组织块。
5. 1000rpm离心5分钟，弃上清，用完全培养基重悬细胞沉淀。
6. 计数细胞，调整细胞浓度，每孔约加入105-106个胸腺细胞。
三、脾细胞饲养层制备
脾细胞作为饲养层细胞使用时，制备方法与胸腺细胞类似，取正常小鼠脾脏，研磨分散细胞，过滤后离心，重悬后即可使用。每孔约加入105个脾细胞。
四、饲养层细胞使用注意事项
1. 饲养层细胞最好在融合前一天或当天接种，以保证细胞处于良好状态。
2. 饲养层细胞一般需要在融合前用丝裂霉素C处理或经射线照射，以阻止其增殖，避免与杂交瘤细胞竞争营养。但由于巨噬细胞和胸腺细胞本身在体外培养条件下增殖能力有限，且在HAT选择培养基中会逐渐死亡，所以也可以不经处理直接使用。
3. 饲养层细胞的数量需要控制，过多会影响杂交瘤细胞的生长和观察，过少则起不到饲养效果。
4. 如果使用商品化的饲养层细胞培养上清，按照说明书稀释后使用即可。
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