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  饲养层细胞的制备
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 饲养层细胞的制备>>>>

    在体外培养细胞实验中,对于难养的细胞或者数量较少的细胞,常常需要预先在培养瓶或培养板底部加入一些活的原代细胞或者静息的肿瘤细胞以辅助目的细胞的生长,这就是饲养层细胞。至于饲养层细胞可以促进其它细胞生长的原理目前有两种解释:一种解释是饲养层细胞可以减小培养瓶或培养板对细胞的毒害作用;另一种解释是饲养层细胞可以释放出一些必要的生长因子,可以促进目的细胞的生长。在单抗制备过程中,刚刚融合的细胞和克隆化的细胞都比较难以生长,因此都需要添加饲养层才能较快地生长。

    在介绍饲养层细胞之前,先来介绍一下制备单抗的培养基体系。

    RPMI 1640培养基(Roswell Park Memorial Institute Medium 1640) RPMI 1640培养基(下面简称1640)最初是Roswell Park Memorial Institute用来培养人的淋巴细胞的培养基,后来被广泛地应用到大部分悬浮细胞的培养中,点击这里查看1640培养基的配方。商品化的1640大多以固体形式出售,也有少数是配好的液体。有的商品化1640中不含碳酸氢钠(稳定pH作用)、不含HEPES(稳定pH作用)、丙酮酸钠(提供碳源)、谷氨酰胺,配制前需要仔细阅读说明书,按照说明书的要求加入需要额外加入的成份,尤其是谷氨酰胺,它是细胞增殖必不可少的成份(参见单抗制备概述部分讲到的核酸的合成),而且谷氨酰胺特别容易分解,配制完培养基后应该尽快用完,暂时不能用完的放在4℃或者-20℃保存。大部份商品化的1640培养基中都含有酚红作为酸碱指示剂,1640的pH为7.2-7.4,指示剂显示为红色(如果偏酸则显黄色,偏碱则呈紫色)。

    DMEM培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 是在Basal Medium Eagle的基础上改进的,最初用于鼠胚胎细胞的培养,后来广泛地应用于各种贴壁细胞的培养或者发酵罐培养。与1640培养基相比,DMEM培养基营养更为丰富。DMEM培养基有两种类型,一种是高糖型,主要用来培养高密度悬浮细胞,另一种是低糖型,主要用来培养普通的贴壁细胞,点击这里查看DMEM培养基配方。与1640培养基一样,商品化的DMEM培养基使用之间也要按照说明书的要求添加指定的成份。

     由于单抗制备(小鼠)中的杂交瘤细胞是半贴壁型的细胞,因此上述两种培养基都可以用来培养杂交瘤细胞。但是这些培养基并不能直接使用,而在使用之前需要加入15%-20%胎牛血清(推荐使用Hyclone公司、Gibco公司或四季青公司胎牛血清),胎牛血清可以为细胞提供更多的生长因子和激素等活性物质,添加了胎牛血清的培养基称为完全培养基,否则称作不完全培养基。在单抗制备中,由于需要进行选择性杀死非目标细胞,所以使用添加HAT的选择性培养基,通常HAT中,H(次黄嘌呤)的浓度为1×10-4M,A(氨基蝶呤)为4×10-7M,T(胸腺嘧啶)为1.6×10-5M,在HT培养基中,只需要不加氨基蝶呤,其它都同HAT。另外,在细胞培养中,一般都加入抗生素防止细胞污染,通常用的抗生素有青霉素(100U/ml)和链霉素(100ug/ml)、四环素(50ug/ml)、庆大霉素(50ug/ml),其中青霉素和链霉素联合使用较为常用,俗称“双抗”。由于细胞培养中几乎所有的成份对高温都不稳定,所以绝对不能使用高温灭菌,而是采用0.22um滤膜过滤除菌。通常,先配好不完全培养基(要加抗生素),然后在超净台上抽滤、分装,取少量分装的培养基加入至液体LB培养基里37℃培养过夜进行无菌测试,其它的培养基则放在-20℃保存。确认培养基无菌后才能使用。HT、HAT则配成相应的母液(可用PBS配制,也可以用不完全培养基配制,一般配为50×浓度保存)。培养基使用前根据需要加入HAT或HT以及血清才可以使用。

    讲完了培养基的基本知识,现在转入正题,关于饲养层细胞的制备。作为饲养层细胞,来源有两种,一种是动物体内天然的细胞,另一种是经过处理的静息的肿瘤细胞。单抗制备中可以使用的饲养层细胞有这么几种:

    (1)腹腔巨噬细胞。巨噬细胞不仅可以作为饲养层,而且它还可以吞噬掉死亡的细胞碎片,起到环境清理的作用。其制备方法是:杀死小鼠,用酒精浸泡数分钟,取出小鼠放在解剖板上,用大头针固定好四肢,在超净台上用一个镊子挑起腹部皮肤,用手术剪刀剪开腹部皮肤,换一把干净镊子夹住腹膜,用另一把镊子捅破腹膜,用巴氏管向腹腔内加两至三管不完全培养基,吹打几次,吸出培养基,吸出的培养基里即含有腹腔巨噬细胞,反复进行两至三次即可基本取彻底。将取出的细胞1200RPM离心5min,去掉上清,向沉淀中加入适量的完全培养基(用于刚融合的细胞需要加HAT,用于克隆化的细胞需要加HT),用巴氏管反复吹打均匀,可用血球计数板计数(一般一只老鼠的腹腔巨噬细胞约为3×106个)。根据计数的结果将巨噬细胞稀释到合适的浓度(以96孔板为例,平均每孔含1×104个巨噬细胞为宜),稀释好后,用巴氏管吸取此饲养层细胞按合适的体积滴到96孔板或24孔板上(平均每只老鼠的腹腔巨噬细胞可铺两至三块96孔板)。饲养层细胞应在使的前一天制备好,这样才能分泌足够的细胞因子。

    (2)脾脏细胞。脾细胞与杂交瘤的来源细胞上有很高的同源性,因此与杂交瘤的“兼容性”较好,是作为饲养层的不错选择。其制备方法和腹腔巨噬细胞过程类似,只是需要剪开腹膜,取出脾脏,用镊子剥去脾脏外的结缔组织,将脾脏放在200目不锈刚细胞筛网上,用5ml注射器的针芯挤压脾脏,使分散的脾细胞通过筛网落入下面的容器(建议使用一次性培养皿,养细菌用的那种比较便宜),用少量不完全培养基冲洗、吹匀脾细胞,收集离心,计数稀释同腹腔巨噬细胞制备过程,一只老鼠的脾脏细胞总数约为2×108-3×108个,以96孔为例,每孔需要约1×105个脾细胞。

    (3)胸腺细胞。胸腺与脾脏中的淋巴细胞最初起源相同,只是各自在不同的器官成熟而已。因此胸腺也是作为饲养层的选择之一,而且与脾细胞不同,胸腺细胞不会分泌抗体而对实验产生干扰。其制备过程类似于脾脏细胞饲养层的制备。只是取胸腺的时候不是打开腹腔,而是打开胸腔,胸腺是位于胸腔与心脏同侧的一小块白色器官,取胸腺时不要与肺混淆。其分离过程与脾脏类似。最终用量以96孔为例,每孔需要约5×105个胸腺细胞。

    (4)放射线照射的成纤维细胞系。小鼠成纤维细胞系易培养,而且不需要以动物作为牺牲,加之技术比较成熟,所以其应用也较多。具体操作是这样的:将NIH3T3细胞传代至细胞培养瓶,密度不超过50%,用新鲜培养基培养24小时,用胰酶消化下来,用培养基重悬至2-4×106个细胞/ml,用剂量为6000rad左右的60Co γ射线照射,换用新鲜的完全培养基稀释至需要的浓度(以96孔板为例,每孔需要约2×104个细胞)滴在培养板里,此过程需要在使前12小时进行。如果一次制备的这种饲养层较多,还可以将其冻存起来(48小时之内可以放4℃保存,长时间则需在液氮中保存)。除了NIH3T3细胞外,还可以使用STO细胞系或者MEF细胞系制备这种饲养层。由于60Co并不是每个实验室都具备,因此这种饲养层的制备受到设备的限制比较大,一种比较好的解决方法就是用丝裂霉素C处理NIH3T3细胞作为饲养层,其方法是:将NIH3T3细胞传代至细胞培养瓶,密度不超过50%,用新鲜的培养基培养24小时,向培养基中加入丝裂霉素C至终浓度为 10ug/ml,继续培养12小时,弃去培养基,用新鲜的培养基洗涤三次,最后一次洗涤放在37℃进行10-20min,将洗好的细胞用胰酶消化下来, 用完全培养基重悬至合适浓度滴在培养板里(以96孔板为例,每孔需要约2×104个细胞),此过程也应在使用前12小时进行。注意:一定要洗干净丝裂霉素C,否则严重影响杂交瘤细胞的生长。

    (5)SP2/0腹水。这种应用比较少,这里只作为一种思路提出。将SP2/0细胞注射到小鼠腹腔,待小鼠产生腹水(一般来说,这种细胞注射到小鼠腹腔内腹水产量较少,可以注射细胞前三天用弗氏不完全佐剂注射腹腔致敏),杀死小鼠,在超净台上取出腹水,其操作与取腹腔巨噬细胞类似。取出腹水后离心去掉离下的细胞,保留上清,将上清加入到完全培养基里即可,一般腹水的浓度为2.5%。这种饲养层的优点是可以减小无关细胞的干扰。

    需要指出的是,饲养层并不是培养杂交瘤细胞一定必须的,但是它确实可以在很大程度上提高细胞的成活率、加快细胞生长速度,因此强烈推荐使用饲养层。

 

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